在体外转录（IVT）过程中获得的mRNA反应混合物中，除了目标mRNA产物外，还含有蛋白质（如T7 RNA聚合酶和无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子以及各种添加剂和mRNA副产物（如双链RNA和截断RNA片段）等杂质。这些杂质的存在可能会对mRNA的功能产生负面影响，比如可能干扰mRNA的定量分析、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，必须使用纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，从而保证产品的安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化以及层析纯化等。在这些方法中，沉淀法、磁珠法和硅胶柱法操作相对简单，纯化速度较快，但由于处理量小，纯化效率有限，通常用于科研和早期应用。而在工业生产中，层析纯化是主要的选择。

硫酸铵沉淀法的研究

例如，在2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队发表了一项关于“室温下快速、高回收率硫酸铵沉淀mRNA”的研究，研究了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码mRNA的硫酸铵沉淀情况。当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。增加硫酸铵浓度对沉淀速率的影响不大。溶解率是另一个重要指标，直接影响mRNA的最终回收率。结果表明，在室温下，硫酸铵浓度超过18M时，沉淀物在不含RNase的水中可迅速溶解，溶解率超过90%。该研究团队推荐的最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS）、pH 7.0、温度20℃、沉淀时间2小时，可实现接近100%的沉淀率和溶解率。

比较不同沉淀法的效果

采用硫酸铵和LiCl的沉淀法对NTP的去除率均超过99%，而DNA模板去除率分别约为82%和85%。硫酸铵沉淀法的T7聚合酶去除效率稍逊于LiCl。此外，硫酸铵沉淀法可在室温条件下进行，为工业生产提供了可行性。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化的原理基于硅胶膜表面的硅醇基团与mRNA之间的相互作用，能够有效分离mRNA和包括蛋白质、多糖、脂类等杂质。硅胶膜的材料安全无毒，环保理念符合现代实验室的要求，非常适合实验室和早期研究阶段的应用。

磁珠法和层析法的应用

在工业级别的纯化中，层析法被广泛应用，以达到更高的核酸质量和产能。目前，主流的mRNA纯化方法是Oligo(dT)亲和色谱，但由于该方法无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和杂质，通常会与疏水层析、阴离子层析结合使用，以提高纯化的精确性。

蛋白酶K纯化及其潜在挑战

目前工业级mRNA纯化工艺通常由TFF1-层析-TFF2步骤组成。TFF1的目的是去除蛋白质、DNA模板和NTPs等杂质，而层析步骤则主要负责捕获mRNA及去除dsRNA等杂质。在IVT产品质量较高的情况下，可以采用蛋白酶K联合TFF的工艺进行下游纯化，以去除与核酸结合的蛋白质杂质。不过，需谨慎添加蛋白酶K，以平衡其可能带来的免疫原性问题。

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