人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒仅供科学研究使用，不适用于医学诊断。

试剂盒原理

本试剂盒采用双抗体一步夹心法进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预先包被的adropin（AD）抗体微孔中，依次加入样本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后，使用TMB底物显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，随后在酸性条件下变为黄色。颜色的深浅与样品中adropin（AD）的浓度呈正相关。采用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），从而计算样本浓度。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟，迅速分离血清和红细胞。
2. 血浆：使用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000转离心10分钟以去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织与生理盐水混合搅拌，3000转离心10分钟取上清。
5. 保存：样本如果不及时检测，按一次用量分装并冻存于-20℃，避免反复冻融，解冻时确保样本完全均匀。

所需物品

1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：05-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1. 试剂盒应保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟，浓缩洗涤液可能出现结晶，需水浴加热后再用；
2. 未用的试剂需立即放回自封袋并密封保存；
3. 0浓度的S0标准品可视为阴性对照；样本稀释后需最终浓度乘以5；
4. 严格按说明书要求的时间、加液量及顺序进行实验；
5. 所有液体组分使用前需充分摇匀。

试剂盒组成

名称：
- 微孔酶标板：12孔×8条或12孔×4条
- 标准品：03mL×6管
- 样本稀释液：6mL或3mL
- 检测抗体-HRP：10mL或5mL
- 20×洗涤缓冲液：25mL或15mL
- 底物A/B：6mL或3mL
- 终止液：6mL或3mL
- 封板膜：2张
- 说明书：1份
- 自封袋：1个

试剂的准备

20×洗涤缓冲液稀释：将蒸馏水与20×洗涤缓冲液按1:20的比例稀释。

洗板方法

1. 手工洗板：甩尽孔内液体，加满洗涤液，静置1分钟后甩去，再用吸水纸拍干，重复5次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1分钟，洗板5次。

操作步骤

1. 从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，其余密封放回4℃；
2. 设置标准品孔与样本孔，标准品孔各加入不同浓度标准品50μL；
3. 样本孔先加入待测样本10μL，再加入稀释液40μL，空白孔不加；
4. 标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，封住反应孔，37℃温育60分钟；
5. 弃去液体，拍干后加满洗涤液，静置1分钟后甩去，重复5次清洗（可用洗板机）；
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟；
7. 每孔加入终止液50μL，并在15分钟内测定450nm波长下的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel中以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制线性回归曲线以计算样本浓度。

试剂盒性能

1. 准确性：标准品线性回归的R值≥0.9900；
2. 灵敏度：最低检测浓度<10pg/mL；
3. 特异性：无交叉反应；
4. 重复性：板内、间变异系数<15%；
5. 贮藏：2-8℃，避光防潮；
6. 有效期：6个月。

免责声明

1. 本试剂盒仅供研究使用，禁止用于临床或人体实验，产生的后果自行承担；
2. 实验者需严格按照说明书操作，违背操作指引的风险自负。

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