IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导，以及类器官培养。在本文中，我们将重点讨论第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

- 细胞：使用H1/H9人胚胎干细胞或患者来源的诱导多能干细胞(iPSCs)。

- 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。

- 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。

- 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）（abs9295）、双抗（abs9244）。

- 生长因子：Activin A（100 ng/mL）（abs05801）、FGF4（500 ng/mL）（abs06269）、WNT3a（500 ng/mL）（abs05632）。

- 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）（abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。

- 血清：透析胎牛血清（abs945）。

- 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

- 内胚层分化培养基：

• Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）+ 双抗（1%）+ Activin A（100 ng/mL）。
• Day 2：Day 1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• Day 3：Day 1配方 + 透析胎牛血清（2%）。

- 中/后肠分化培养基：

- RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500 ng/mL） + WNT3a（500 ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

- 使用人多能干细胞消化液处理hPSCs，直至边缘细胞卷起。

- 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，并反复吹打至1-2mm大小的细胞团。

- 按1:6的比例将其接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团）。

- 轻敲培养板以确保细胞均匀分布，随后在37°C环境下过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

- 每日更换人多能干细胞培养基，并观察细胞密度。

- 注意：密度过高会导致自发分化，密度过低则会降低分化效率，此时需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. Day 1

吸除人多能干细胞培养基，加入无血清的Day 1内胚层培养基，培养24小时。

2. Day 2

更换为含0.2%透析胎牛血清的Day 2内胚层培养基，培养24小时。

3. Day 3

更换为含2%透析胎牛血清的Day 3内胚层培养基，培养24小时。

4. 验证分化效率（可选）

- 通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，期待分化效率达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

- 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，并每日更换。

- 48小时后，通过立体显微镜观察上皮增厚，72-96小时后，形成的球状体(spheroids)将脱离单层细胞。

2. 收集球状体

- 使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

通过上述步骤，您可以有效地进行内胚层分化及中/后肠模式化诱导，以便后续的类器官培养。这项技术为研究肠道发育和疾病机制提供了强有力的工具。

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